Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-辰恩生物CEbiotech

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

产品货号：GK10001

品牌：GLPBIO

产品规格：5ml/500T

产品价格：￥240

优惠价格：￥80

说明书

产品概述产品详情文献引用

Description

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）使用WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酚基)-2H-tetrazolium，单钠盐），在存在电子载体1-Methoxy PMS的情况下，产生水溶性福尔马定染料进行方便的测定。 CCK-8溶液直接加入到细胞中，无需预先混合组分。 WST-8被细胞脱氢酶生物还原为可溶于组织培养液的橙色福尔马定产物。产生的福尔马定量与活着的细胞数量成正比。由于CCK-8溶液非常稳定且具有很小的细胞毒性，因此可以进行更长时间（例如24至48小时）的孵育。

细胞计数试剂盒 - 8允许灵敏度高、用于增殖和毒性测定中确定存活细胞数量的显色法检测。检测灵敏度比MTT、XTT或MTS等任何其他四唑盐都要高。

CCK-8

图1：Cell Counting Kit-8（CCK-8）的工作机制。

实验参考方法

细胞数量确定

1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

细胞增殖和细胞毒性测定
1.将种子细胞以10³-10⁴个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。
2.将不同浓度的待测物质加入板中。
3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。
4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
6.在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。
7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

数据分析
统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。
细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。
Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作标准曲线
1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。
2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）
3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100 μl培养基加入10 μl CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。
可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项
1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。
2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。
3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。
4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。
5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。
7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。
8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2 μm的膜过滤溶液。
9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~10⁵细胞/孔）。
10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。
11. CCK8不能用于细胞染色。
12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）
14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。
15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。
16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。
17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。
18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。
19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

常见问题

Q：如何做空白对照？
A：可以用加相应量细胞培养基和CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照，若担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照。

Q：只加CCK-8不加细胞的空白孔，数值上增？
A：在整个实验过程中，随着时间的增加，如果细胞培养时间较长，请注意蒸发问题。因为反应环境温度较高，会有部分液体挥发。空白组虽然没有细胞，但是随着液体的挥发，药物浓度相当于提高了，所以空白对照的数值也会有轻微的变化（但不会有明显的变化）。如果很在意空白对照的数值，可将96孔板外围一圈加培养基、水或PBS 保湿。同时，可以把96孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发。将96孔板外围两圈用PBS铺板，这样挥发先挥发周边的，可以对内部及空白对照的影响降至最低。

Q：一般多久测一次值？
A：预实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

Q:加入CCK8后暂时不测OD值，可以如何处理暂时保存？能够保存多久？
A:如果需要暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室温，24小时内吸光度不会发生变化。

Q:如何保存？
A:CCK-8溶液在避光、0-5℃的条件下可以保存1 年，若长期不用可在-20℃下避光保存2年。建议分装后保存于-20℃，使用时提前于4℃解冻，请避免反复冻融，否则增加背景值，干扰实验结果。

Q:是否需要更换培养基？
A:不需要，若药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

Q:待测物质有氧化性或还原性该做何处理？
A:本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
如果实验中有还原剂，请检查背景的OD值，即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只有CCK-8试剂），如果O.D值明显偏高，则说明有反应。

Q:如果培养基颜色或PH已变化，是否需要更换新的培养基？
A:加入CCK-8时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH值已变化，建议换用新鲜的培养基。

Q:适用细胞？
A:因为测线粒体酶，所以真核细胞，有线粒体的均可，例如单细胞，动物细胞。但有细胞壁的细胞，例如植物细胞，酵母细胞，底物进入细胞效率低，不推荐。

Q:线性不佳原因？
A:细胞不均；培养液蒸发；还原剂；气泡；孔板周围一圈不能用，除非只培养少于一天的时间；细胞数目很重要，太少信号会低。

Q:金属毒性？
A:可以检测金属毒性，最好做空白对照。

Q:适用于那些细胞？其他还有哪些细胞可用？生物被膜内的活菌 (流感嗜血杆菌和绿脓杆菌)？
A:所有哺乳动物的细胞，细菌一般没有检测CCK8的，可以染色法，或者流式，最常规的方法，有报道，比浊法测OD600。

Q:是否可以替代Brud或EDU法检测细胞增殖？
A:虽然CCK8通过检测对生长期的细胞内的脱氢酶来反应细胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通过核苷酸类似物的方式插入合成的DNA来检测细胞的活性，这几种方法是有一定关联性的，CCK8可替换胸腺嘧啶插入法来检测细胞增殖，并且检测更方便。

Q:空白孔数值偏高，有可能是培养基长菌吗？或者其他原因？
A:空白孔数值偏高一般认为染菌造成的，很少出现这种问题。

Q:CCK8能检测组织吗
A:不能检测组织。

Q:是否可以检测T细胞
A:可以，T细胞长的慢，需延长孵育时间。

Q:当两个细胞混合培养时（骨髓间充质细胞，另一个是悬浮T细胞），培养一段时间后，只测骨髓间充质干细胞的生长、增殖情况，请问用CCK-8能测吗？怎么做？
A:对于两种细胞的情况:
1）如果测定贴壁细胞的生长状况，那么可以把悬浮的T细胞转移掉，使用上述第二种方法测定。
2）如果T细胞对于间充质细胞的生长很关键，不能取走，那么测定的活性程度是总量，此时，需要对每一个孔的T细胞进行估算，如果每个培养条件下T细胞总量接近，或者T细胞含量很少，远远小于间充质细胞，也可以测定，使用对照孔可以去除T细胞的影响。
3）如果T细胞可以短时间内除去，可以找个灵敏度高的CCK-8，信号强，建议细胞量合适的情况下（每一个孔10000个），30分钟左右出读数结果，测定后，可以将T细胞再加入培养孔。这样做对细胞的生长影响不大。但是如果做动力学，那么要考虑的因素多一些。

Q:CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶反应而反映着细胞数量，假如细胞已经死亡，而脱氢酶活性还有，那么如何计算细胞数量？
A:多数情况下，细胞死亡过程中，细胞内的成分会降解，脱氢酶会有部分释放，但是活性和活细胞比，比较低。举例说：100个细胞死亡20小时后，释放的脱氢酶活力，不足5个活细胞的脱氢酶活力，也就是说，这种情况带来的误差5％以内。而且，这种细胞死亡，对同种细胞来说，情况是一样的，一般都是在不同的孔间比较同种细胞，所以系统误差是一样的，即系统误差会彼此消减。

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lInt Immunopharmacol 107 (2022): 108695.PMID:35305385

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lPlos Pathog 19.4 (2023): e1011305.PMID:37053288jpg

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lVaccines Basel 11.7 (2023): 1190.PMID:37515006

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lEnviron Pollut 338 (2023): 122581.PMID:37748638

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lPhytomedicine 122 (2024): 155091.PMID:37844378

lPlos Pathog 19.10 (2023): e1011702.PMID:37801439

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lDiscov Oncol 14.1 (2023): 1-10.PMID:37907650

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lJ Steroid Biochem (2023): 106429.PMID:38035949

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lInt J Mol Sci 24.22 (2023): 16503.PMID:38003694

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lJ Ethnopharmacol 319 (2024): 117205.PMID:37741473

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lJ Mol Neurosci 74.1 (2024)：30.PMID:38478195

lPediatr Surg Int 40.1 (2024): 63.PMID:38431920

lJ Cell Mol Med 28.6 (2024)：e18223.PMID:38451046

lCell Commun Signal 22.1 (2024)：1-19.PMID:38454413

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lBmc Cancer 24.1 (2024)：1-16.PMID:38475728

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lCell Mol Life Sci 81.1 (2024)：143.PMID:38493426

lCurr Stem Cell Res T 19.7 (2024)：1021-1028.PMID:37861049

lEur J Med Chem (2024)：116323.PMID:(2024) 116323.

lFitoterapia (2024)：105884.

lJ Biochem Mol Toxic 38.4 (2024)：e23675.PMID:38488158

lJ Nanobiotechnol 22.1 (2024)：1-21.PMID:38448959

lMater Today Bio (2024)：101019.PMID:38516170

lSci Adv 10.10 (2024)：eadg7380.PMID:38457499

lAm J Physiol-Cell Ph (2024).PMID:38525543

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lExp Ther Med 27.5 (2024)：1-16.

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lInt Immunopharmacol 131 (2024)：111922.PMID:38522137

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lStem Cell Transl Med (2024)：szae020.PMID:38530131

lBiomarkers (2024)：1-12.PMID:38568742

lBiomed Pharmacother 174 (2024)：116470.PMID:38565061

lBrain Behav Immun (2024).PMID:38565398

lCancer Cell Int 24.1 (2024)：123.PMID:38566075

lFront Bioeng Biotech 12 (2024)：1361682.PMID:38562665

lInt Immunopharmacol 132 (2024)：111870.PMID:38547771

lJ Agr Food Chem (2024).

lNanoscale (2024).

lPhytother Res (2024).PMID:38558449

lRedox Biol (2024)：103143.

lAcs Appl Opt Mater (2024).

lBmc Complement Med 24.1 (2024)：1-16.PMID:38580999

lBrit J Cancer (2024)：1-9.PMID:38594370

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lHeliyon (2024).

lAcs Pharmacol Transl (2024).

lActa Derm-Venereol 104 (2024).PMID:38590175

lAdv Funct Mater (2024)：2402663.

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lBmc Cancer 24.1 (2024)：465.PMID:38622522

lMacromol Biosci (2024)：2400003.PMID:38597147

lSmall Methods (2024)：2400223.PMID:38602202

lBba-Gen Subjects (2024)：130628.PMID:38642815

lCells 13.9 (2024)：728.

lFuture Microbiol 0 (2024).PMID:38629914

lPharmaceuticals-Base 17.4 (2024)：515.

lRsc Adv 14.18 (2024)：12864-12872.PMID:38650686

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lAcs Appl Bio Mater (2024).PMID:38700956

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lEnviron Toxico (2024).PMID:38700384

lFood Chem (2024)：139505.PMID:38703732

lHeliyon (2024).PMID:38707472

lInt J Biol Macromol (2024)：131928.PMID:38688339

lNanoscale 16.17 (2024)：8479-8494.PMID:38590261

lNat Commun 15.1 (2024)：3771.PMID:38704377

lPediatr Res (2024)：1-10.PMID:38658662

lPhytomedicine (2024)：155656.

lTransl Cancer Res 13.4 (2024).

lAdv Funct Mater (2024)：2400489

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lAdv Mater (2024)：2401538.PMID:38738793

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